天博體育隨著循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)技術(shù)的飛速發(fā)展，應(yīng)用ctDNA檢測實體瘤MRD已經(jīng)成為當(dāng)前的熱點。

　　MRD指腫瘤患者接受根治性治療后即便達到完全緩解（CR），體內(nèi)仍然殘存有腫瘤細胞的狀態(tài)。這個概念首先是出自血液病，在血液病的治療過程中我們發(fā)現(xiàn)，在大量的化療治療后，在血液里面還能檢測到癌細胞，由于殘留的細胞數(shù)量較少無法在影像學(xué)中檢測到，所以稱之為微小殘留病灶。 在2021年6月發(fā)布的《非小細胞肺癌分子殘留病灶專家共識》中，定義肺癌分子殘留病變?yōu)榻?jīng)過治療后，傳統(tǒng)影像學(xué)（包括PET/CT）或?qū)嶒炇曳椒ú荒馨l(fā)現(xiàn)，但通過液體活檢發(fā)現(xiàn)的癌來源分子異常。這些分子殘留病變代表著肺癌的持續(xù)存在和臨床進展可能。肺癌MRD的檢測具有多項功能，可用于患者的預(yù)后預(yù)測、風(fēng)險分層、復(fù)發(fā)監(jiān)測、療效評估等，從而實現(xiàn)非小細胞肺癌患者圍術(shù)期的全程動態(tài)監(jiān)測管理。但因為微小殘留病灶極小或殘留腫瘤細胞量極少，通過傳統(tǒng)影像學(xué)或其它實驗方法已經(jīng)很難檢測到，因而需要更加靈敏的檢測技術(shù)。

　　隨著循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)技術(shù)的飛速發(fā)展，應(yīng)用ctDNA檢測實體瘤MRD已經(jīng)成為當(dāng)前的熱點。

　　目前，對于微小病灶殘留的檢測，主要包括三大類： （1）基于固定組成的大panel：使用類似TMB的大panel進行大范圍的ctDNA檢測，如吉因加、世和、和瑞的固定化panel；優(yōu)勢在于開發(fā)成本低，可實現(xiàn)高通量生產(chǎn)，但能保證的單點測序深度較低。 （2）基于定制化的小panel：使用個性化定制的panel（多為多重PCR）對某幾個位點進行檢測（一般8或16個），可實現(xiàn)10000×的測序深度，如華大，Guardant，GRAIL等；優(yōu)勢在于測序成本低，單點深度高，但需要針對患者進行個性化定制，開發(fā)成本較高。 （3）聯(lián)合SNP和甲基化檢測的panel：在前兩者基礎(chǔ)上，聯(lián)合甲基化檢測對tumor來源的ctDNA進行組織定位，從而提高準(zhǔn)確性。目前國內(nèi)主要以燃石為代表天博體育。

　　從微小殘留病灶的臨床性質(zhì)可知，釋放入血的ctDNA含量極其微量，無論是哪種方法，都需要對超低豐度的ctDNA有著較好的敏感性。Asaf Zviran等人建立了輸入的血漿量與檢測到的tumor腫瘤數(shù)量的雙端皮爾遜檢驗?zāi)Ｐ停l(fā)現(xiàn)二者具有相關(guān)性，從而證明了input核酸量時限制靶向測序突變檢測的潛在限制因素。同時，他們證明了WGS可以獲得比靶向捕獲測序更高的突變檢出率?；谶@一研究結(jié)果，用測序廣度替代測序深度來克服cfDNA低起始量是可靠的，MRDetect即基于該原理進行開發(fā)，靈敏度可達10^-5。 然而，MRDetect采用WGS的方法進行檢測，意味著將導(dǎo)致巨大的檢測成本，不利于MRD需要長期隨訪動態(tài)檢測的特性。因而，目前的定制化方法大多采用廣度和深度結(jié)合的策略。一般，對腫瘤組織進行WES或較大panel的廣度篩選，從中挑選若干有意義的體細胞突變，設(shè)計定制化的小panel，使用這些小panel對血液中cfDNA進行檢測。這種方案兼顧了不同患者之間的差異性與檢測本身的精確性，已經(jīng)逐漸成為國外各個基因檢測公司的首選，目前Natera的IVD產(chǎn)品即基于該方法。

　　基于LC目前技術(shù)平臺的實際情況，Natera的方法具有較高的可信性：即先基于Agilent or IDT的全外顯子探針對患者的腫瘤組織(FFPE)進行檢測，從中挑選出有意義的體細胞突變，基于Variant Pro系統(tǒng)進行定制化panel設(shè)計（需帶有UMI），預(yù)期檢測0.02%級別以上的ctDNA突變。

　?。?）根據(jù)MRD檢測結(jié)果預(yù)測用藥療效傳統(tǒng)的ctDNA檢測已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用在用藥療效檢測上，典型的如血液EGFR T790M突變被用于指示EGFR 一代TKI的耐藥。在此基礎(chǔ)上，有更多的證據(jù)證明天博體育，ctDNA殘留水平可以指示更多的藥物療效。Powles T等人發(fā)現(xiàn)，ctDNA陽性患者接受atezolizumab得到了改善，而ctDNA陰性組沒有顯著差異；6周后，atezolizumab組的ctDNA清除率高于對照組（18% vs 4%）；同時，復(fù)發(fā)相關(guān)的基因在兩組之間也發(fā)生了差異表達。Bratman S V等人發(fā)現(xiàn)，ctDNA在免疫檢查點抑制劑（ICB）治療前后發(fā)生的變化，可以指示ICB的療效：ctDNA清除率高的患者意味著較好的ICB應(yīng)答。

　?。?）根據(jù)MRD檢測結(jié)果監(jiān)控腫瘤復(fù)發(fā) 腫瘤復(fù)發(fā)來源于體內(nèi)未被清楚的癌細胞，因而，檢測癌細胞釋放的ctDNA通常比傳統(tǒng)的放射檢查（如CT）更早地發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)的腫瘤。Charles Coombes等人在49位乳腺癌患者中持續(xù)檢測血液ctDNA突變情況，顯示ctDNA陽性的患者，預(yù)后顯著差于陰性患者，且隨著時間進展，ctDNA陽性患者的突變VAF會逐漸升高，證明了cfDNA圖譜可以用于檢測乳腺癌復(fù)發(fā)。Tarazona N等人檢測了150位局限性結(jié)直腸癌患者的血液ctDNA變化天博體育，并進行ddPCR驗證，證明了ctDNA的存在與早期復(fù)發(fā)相關(guān)，比放射性檢查要早；且追蹤至少2種突變可以提高MRD的識別能力到87.5%；同時證明了在連續(xù)的血漿樣本中使用多個突變跟蹤可以提高MRD的準(zhǔn)確性[5]。這一結(jié)論也支持了需要采用多個突變位點進行高深度測序來監(jiān)控MRD。Chaudhuri A A等人利用CAPP-Seq進行超深度測序，證明MRD可以可靠鑒別腫瘤復(fù)發(fā)，且72%的患者ctDNA進展比放射學(xué)進展快5.2個月。 對于一些沒有熱點突變的癌種，MRD檢測同樣具有指導(dǎo)預(yù)后的能力。Lee B等人首次提出對于沒有生物標(biāo)志物來指導(dǎo)治療方案選擇時，可以評估cfDNA的變化來指導(dǎo)預(yù)后：在胰腺癌患者中，他們發(fā)現(xiàn)檢測到ctDNA的患者（13/13）均發(fā)生了復(fù)發(fā)，表明cfDNA在術(shù)前術(shù)后的變化可以作為一個預(yù)后治療，可以對術(shù)后檢測ctDNA陽性的患者進行強化治療策略。

　　（3）根據(jù)MRD檢測結(jié)果聯(lián)合分析無復(fù)發(fā)生存期（RFS）和總生存期（OS） MRD不僅可以作為一種生物標(biāo)志物指導(dǎo)復(fù)發(fā)的可能性，也可以作為預(yù)后指標(biāo)用于預(yù)測患者的無進展生存期和總生存期。Bratman S V等人采用△ctDNA聯(lián)合傳統(tǒng)的RECIST模型可以提高Cox模型預(yù)測OS的準(zhǔn)確性，ctDNA陰性代表著更好的預(yù)后。Peng M等人采用cSMART技術(shù)檢測非小細胞肺癌腫瘤組織中的體細胞突變和血漿中的MRD，并采用kaplan-meier和Cox回歸分析評估RFS和OS，證明ctDNA的檢出與RFS和OS負相關(guān)。

　　Maria Coakley等人在Clinical Cancer Research上發(fā)表了關(guān)于MRD臨床試驗設(shè)計的具體策略，具體如下：（1）實體瘤切除后輔助治療療效尚不確定的癌種（如II期結(jié)直腸癌）① 隨機型：將入組病例隨機分為兩組，一組進行常規(guī)的輔助化療；另一組基于MRD檢測結(jié)果，ctDNA陽性患者進行輔助化療，ctDNA陰性患者不進行干預(yù)，并持續(xù)檢測MRD水平。保持隨訪，評價無病生存期（DFS） ② 非隨機型：對入組病例進行MRD檢測，對ctDNA陽性患者進行化療，ctDNA陰性患者不進行干預(yù)并持續(xù)檢測MRD水平。保持隨訪，評估無病生存期。 該類研究主要證明ctDNA陰性具有較好的預(yù)后，且化療并不能使他們獲得DFS益處。通常采用隨機型試驗，非隨機型試驗需要的入組病例更低，但必須要求腫瘤具有較低的復(fù)發(fā)風(fēng)險基線 輔助治療尚不確定的癌種臨床試驗設(shè)計

　?、?隨機型：對入組病例進行MRD檢測，ctDNA陰性患者繼續(xù)進行標(biāo)準(zhǔn)治療；ctDNA陽性患者隨機分成2組，一組在標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上增加額外治療，而另一組在標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上增加安慰劑處理。持續(xù)隨訪驗證ctDNA清除是否可以替代DFS作為研究終點 ②非隨機型：對入組病例進行MRD檢測，ctDNA陰性患者繼續(xù)進行標(biāo)準(zhǔn)治療，ctDNA陽性患者在標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上增加額外治療。持續(xù)隨訪，驗證ctDNA的清除情況。 該類研究主要用于指導(dǎo)額外的治療手段是否需要進行。通常采用隨機型的方法，只有當(dāng)ctDNA已經(jīng)被證明可以替代DFS作為研究終點時，可以采用非隨機型的方法。同時，ctDNA的檢測結(jié)果也可以作為疾病的分型參考指標(biāo)。

　　一般采用隨機型試驗，將入組病例隨機分為兩組，一組采用傳統(tǒng)的輔助治療，另一組采用傳統(tǒng)輔助治療和新的治療手段，對兩組均進行持續(xù)的MRD檢測，評價MRD檢出情況和DFS。 該類研究主要用于證明MRD檢出情況可以替代DFS作為藥物開發(fā)臨床試驗的替代終點，從而縮短臨床藥物的審批時間，加速藥物開發(fā)流程，因而一般需要和藥廠聯(lián)合開展臨床試驗。